多磷酸化肽標記技術

蛋白質磷酸化是生物界普遍，也是重要的一種蛋白質翻譯后修飾，20世紀50年代以來一直被生物學家看作是一種動態(tài)的生物調節(jié)過程。在細胞中，大概有1/3的的蛋白質被認為是通過磷酸化修飾的。蛋白質的磷酸化修飾與多種生物學過程密切相關，如DNA損傷修復、轉錄調節(jié)、信號傳導、細胞凋亡的調節(jié)等。磷酸化蛋白質及多肽的研究可以幫助人們闡述上述過程的機理，進一步認識生命活動的本質。近年來隨著蛋白質組技術的不斷發(fā)展，蛋白質磷酸化的研究越來越受到廣泛的關注。

蛋白質磷酸化在細胞信號轉導中的作用
磷酸化多肽主要指肽鏈中的Ser、Tyr和Thr殘基的側鏈羥基被修飾成酸式磷酸酯多肽。磷酸化多肽是研究蛋白質磷酸化過程的的工具，因此研究蛋白質及多肽的磷酸化反應并確定成熟簡便的合成路線就變得非常重要。目前為止，多肽的磷酸化修飾主要有后磷酸化法和單體法兩種合成方法。后磷酸化法是多肽序列在樹脂上合成完后，再對其中的Ser、Tyr或Thr的側鏈羥基進行磷酸化；單體法則是將適當保護的磷酸化氨基酸直接引入到多肽序列中，這種方法較后磷酸化法操作更為簡便，已經成為多肽磷酸化修飾的主要方法。
單體法修飾時，磷酸化的氨基酸由于側鏈修飾的較大基團產生的位阻而導致難以與肽鏈縮合，并且之后的氨基酸引入都會比較困難，尤其在含有多個磷酸化位點修飾時，合成將變得異常困難，并且終產物成分復雜，難以分離，產率極低。因此，當肽鏈中多個位點進行磷酸化時，可以考慮采用后磷酸化法，其合成過程主要就是在多肽合成結束之后，選擇性的脫去要標記氨基酸的側鏈保護基，對于Tyr，Thr可以直接使用側鏈不保護的氨基酸進行反應。側鏈保護基在1%TFA/DCM條件下可以定量的脫除。后磷酸化時，可以采用雙芐基亞磷酰胺，四氮唑生成亞磷酰胺四唑活性中間體，連接到羥基上，然后在過氧酸條件下氧化生成磷酰基，完成反應。

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成功案例:
序列NH2-TERD(pS)D(pT)DVEEDSRPPGRPAEVHLERAQPFGFID(pS)D(pS)DAEEEY-CONH2，四個磷酸化修飾位點。
HPLC分析：

MS分析：

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