綿羊γ素誘導(dǎo)單核細(xì)胞因子(MIγ/CXCL9)ELISA試劑盒

雙夾心：本法主要用于檢測(cè)大分子抗原。現(xiàn)以檢測(cè)雞傳染性法氏囊?。↖BDV）的雙夾心ELISA為例介紹本法的操作程序。① 加包被 → 4℃過夜，洗滌三次、拋干② 加待檢抗原 → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干③ 加酶標(biāo) → 37℃ 30分鐘，洗滌三次、拋干④ 加底物液　→ 37℃ 15分鐘，加終止液⑤ 用ELISA檢測(cè)儀測(cè)定OD值。

綿羊γ素誘導(dǎo)單核細(xì)胞因子(MIγ/CXCL9)ELISA試劑盒

辣根過氧化物酶：過氧化物酶（HRP）廣泛分布于植物中，辣根中含，從辣根中提取的稱辣根過氧化物酶（HRP），是由無色酶蛋白和深棕色的鐵卟啉構(gòu)成的一種糖蛋白（含糖量18%），分子量約40 000，約由300個(gè)酸組成，等電點(diǎn)為pH 3-9，催化反應(yīng)的適pH值因供氫體不同而稍有差異，一般多在pH 5左右。此酶溶于水和50%飽和度以下的銨溶液。酶蛋白和輔基吸收光譜分別為275nm和403nm。

試劑盒操作步驟：

   實(shí)驗(yàn)開始前，請(qǐng)?zhí)崆芭渲煤盟性噭?，試劑或樣品稀釋時(shí)，均需混勻，混勻時(shí)盡量避免起泡。每次檢測(cè)都應(yīng)該做曲線。如樣品濃度過高時(shí)，用樣品稀釋液進(jìn)行稀釋，以使樣品符合試劑盒的檢測(cè)范圍。

1.加樣：分別設(shè)空白孔、孔、待測(cè)樣品孔。空白孔加樣品稀釋液100μl，余孔分別加品或待測(cè)樣品100μl，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻，酶標(biāo)板加上蓋或覆膜，37℃反應(yīng)120分鐘。 為實(shí)驗(yàn)結(jié)果有效性，每次實(shí)驗(yàn)請(qǐng)使用新的品溶液。

2.棄去，甩干，不用洗滌。每孔加生物素標(biāo)記工作液 100μl（取1μl生物素標(biāo)記加99μl生物素標(biāo)記稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時(shí)內(nèi)配制），37℃,60分鐘。

3.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

4.每孔加辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素工作液（同生物素標(biāo)記工作液） 100μl，37℃，60分鐘。

5.溫育60分鐘后，棄去孔內(nèi)，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分鐘，350μl/每孔，甩干。

6.依序每孔加底物溶液90μl，37℃避光顯色（30分鐘內(nèi)，此時(shí)可見品的前3-4孔有明顯的梯度藍(lán)色，后3-4孔梯度不明顯，即可終止）。

7.依序每孔加終止溶液50μl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)）。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物液的加入順序相同。為了實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，底物反應(yīng)時(shí)間到后應(yīng)盡快加入終止液。

8.用酶聯(lián)儀在450nm波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的光密度（OD值）。在加終止液后15分鐘以內(nèi)進(jìn)行檢測(cè)。

標(biāo)本的采集及保存：

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  ：全血標(biāo)本請(qǐng)于室溫放置2小時(shí)或4℃過一晚后于1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
  

  
  


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  ：可用EDTA或肝素作為抗凝劑，標(biāo)本采集后30分鐘內(nèi)于2 - 8° C 1000 x g離心15分鐘，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。
  

  
  


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  細(xì)胞物上清或其它生物標(biāo)本：1000 x g離心20分鐘，取上清即可檢測(cè)，或?qū)?biāo)本放于-20℃或-80℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融。 (注：標(biāo)本溶血會(huì)影響**檢測(cè)結(jié)果，因此溶血標(biāo)本不宜進(jìn)行此項(xiàng)檢測(cè)。)
  

  
  


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  標(biāo)本的稀釋原則：通過文獻(xiàn)檢索的了解待測(cè)樣本的大致含量，確定適當(dāng)?shù)南♂尡稊?shù)。只有稀釋至曲線的范圍內(nèi)，檢測(cè)的結(jié)果才是準(zhǔn)確的。稀釋的中，應(yīng)做好詳細(xì)的記錄。計(jì)算濃度時(shí)，稀釋了“N”倍，標(biāo)本的濃度應(yīng)再乘以“N”。
  

  
  


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  品的稀釋原則：2瓶，每瓶臨用前以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后靜置10分鐘以上，然后反復(fù)顛倒/搓動(dòng)以助溶解，其濃度為300 pg/ml，做系列倍比稀釋后，分別稀釋300 pg/ml，150 pg/ml，75 pg/ml，37.5 pg/ml，18.5 pg/ml，9 pg/ml，4.5 pg/ml，樣品稀釋液直接作為濃度0 pg/ml，臨用前15分鐘內(nèi)配制。 如配制150 pg/ml品：取0.5ml（不要少于0.5ml）300 pg/ml的上述品加入含0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
  

  
  


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  生物素標(biāo)記的稀釋原則：臨用前以生物素標(biāo)記稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl生物素標(biāo)記加990μl生物素標(biāo)記稀釋液的比例配制，輕輕混勻，在使用小時(shí)內(nèi)配制。
  

  
  


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  辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素的稀釋原則：臨用前以辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液稀釋，稀釋前根據(jù)預(yù)先計(jì)算好的每次實(shí)驗(yàn)所需的總量配制（每孔100μl），實(shí)際配制時(shí)應(yīng)多配制0.1-0.2ml。如10μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素加990μl辣根過氧化物酶標(biāo)記親和素稀釋液 的比例配制，輕輕混勻，在使用小時(shí)內(nèi)配置
  

  
  

用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的。顏色的深淺和樣品中呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD值），計(jì)算樣品濃度。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果計(jì)算：

    以物的濃度為橫坐標(biāo)（對(duì)數(shù)坐標(biāo)），OD值為縱坐標(biāo)（普通坐標(biāo)），在半對(duì)數(shù)坐標(biāo)紙上繪出曲線，根據(jù)樣品的OD值由曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用物的濃度與OD值計(jì)算出曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實(shí)際濃度。

繪制曲線：在Excel工作表中，以品濃度作橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)OD值作縱坐標(biāo)，繪制出品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值。

注意事項(xiàng)：

1.當(dāng)混合蛋白溶液時(shí)應(yīng)盡量輕緩，避免起泡。

2.洗滌非常重要，不充分的洗滌易造成假陽性。

3.一次加樣時(shí)間**控制在5分鐘內(nèi)，如標(biāo)本數(shù)量多，建議使用排槍加樣。

4.請(qǐng)每次測(cè)定的同時(shí)做曲線，做復(fù)孔。

5.如標(biāo)本中待測(cè)含量過高，請(qǐng)先稀釋后再測(cè)定，計(jì)算時(shí)請(qǐng)乘以稀釋倍數(shù)。

6.在配制品、檢測(cè)溶液工作液時(shí)，請(qǐng)以相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。

7.底物請(qǐng)避光保存。

8.不要用其它生產(chǎn)廠家的試劑替換試劑盒中的試劑。

試劑盒性能

1．準(zhǔn)確性：品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值，大于等于0.9900。

2．靈敏度檢測(cè)濃度小于10 pg/ml。

3．特：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng)。

4．重復(fù)性：批內(nèi)與批見應(yīng)分別小于9%和15%。